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Temas em investigação Projectos financiados Publicações seleccionadas
TEMAS EM INVESTIGAÇÃO

CARACTERIZAÇÃO DO PAPEL DO FACTOR DE TRANSCRIÇÃO DRG11 NO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO DO SISTEMA NOCICEPTIVO
Deolinda Lima, Sandra Rebelo, Carlos Reguenga, Claudia Lopes

O Drg11 foi recentemente identificado pelo grupo, em colaboração com David Anderson, CalTech, como um gene primariamente implicado no desenvolvimento embrionário do sistema nociceptivo. O trabalho em curso, relativo ao seu real papel no desenvolvimento dos diversos componentes do sistema, desenvolve-se em três frentes.

  1. Estudo funcional de ratinhos knockout para o Drg11: avaliação de defeitos de formação/diferenciação de neurónios aferentes primários, espinhais e encefálicos por meio da observação dos mesmos com marcadores apropriados em tempos de vida pré-natal e pós-natal sucessivos; avaliação do estabelecimento de circuitos neuroniais pela utilização de substâncias traçadoras em embriões de diversas idades e em ratinhos adultos.


  2. Caracterização da evolução fenotíca dos neurónios que exprimem Drg11 ao longo do desenvolvimento embrionário por meio de estudos de co-localização do Drg11 com outros factores de transcrição e neurotransmissores.


  3. Identificação dos genes que se encontram sob o controlo do Drg11 por meio de estudos de imunoprecipitação e de screening genético diferencial a partir de embriões de ratinhos knockout e wild-type para o drg11.



TRANSFECÇÃO DE NEURÓNIOS ENCEFÁLICOS COM VECTORES VÍRICOS PARA MANIPULAÇÃO DO SISTEMA DE CONTROLO ENDÓGENO DA DOR
Deolinda Lima, Isaura Tavares, Marta Pinto, Isabel Martins

O processamento de informação dolorosa pelo sistema nervoso central está sujeito a controlo endógeno gerado em múltiplas regiões encefálicas. Estudos efectuados no laboratório revelaram a existência de uma região facilitadora da dor e esclareceram diversos aspectos da anatomia e neuroquímica desta área, bem como de outras implicadas na inibição da dor.
Em colaboração com Steven Wilson, Carolina do Sul, estamos a trabalhar na produção de vectores víricos que, uma vez injectados por estereotaxia em determinadas áreas encefálicas implicadas no controlo da dor, transfectem neurónios que para lá projectem de modo a alterar o seu fenótipo neuroquímico. Por este processo, através do aumento ou bloqueio da acção sináptica de neurotransmissores seleccionados sobre os neurónios alvo, pretende-se estimular especificamente neurónios que promovem inibição da dor e bloquear em simultâneo neurónios que induzem facilitação. As áreas de controlo da dor seleccionadas são a substância reticular ventrolateral caudal do bolbo raquidiano, com potente acção inibitória, e o núcleo reticular dorsal do bolbo raquidiano, a única região conhecida com acção primariamente facilitatória no controlo da dor.

De acordo com os resultados referentes à plasticidade neuroquímica dos dois sistemas em situações de dor crónica e à dinâmica de migração do vector (HSV-1) após administração a cada um dos núcleos, encontram-se em fase de construção e ensaio vectores com expressão restringida a neurónios que sintetizam noradrenalina e que codificam uma das enzimas da sua via metabólica ou que bloqueiam a transcrição do respectivo gene. Paralelamente, estão a ser construídos vectores lentivíricos destinados a alterar localmente a expressão de vários receptores.



PLASTICIDADE DO SISTEMA ENDÓGENO DE CONTROLO DA DOR EM SITUAÇÕES DE DOR CRÓNICA. MANIPULAÇÃO FARMACOLÓGICA.
Isaura Tavares, Deolinda Lima, Marta Pinto e Isabel Martins

O processamento de informação nociceptiva pelo sistema endógeno de controlo da dor está alterado em circunstâncias de dor crónica por comparação com a dor dita fisiológica. O projecto tem por objectivo identificar, em alguns componentes do sistema, modificações dos receptores de membrana decorrentes do estabelecimento de dor crónica inflamatória. Estes dados constituem-se em informação valiosa para a definição de estratégias terapêuticas, entre as quais a terapia génica em avaliação no nosso Laboratório. Os trabalhos desenvolvidos têm usado um modelo experimental de dor crónica inflamatória, a monoartrite no Rato. Foram já caracterizados imunocitoquimicamente os receptores de opióides tipo µ, NK-1, GABAB e α2 de neurónios nociceptivos do tronco cerebral e medula espinhal em animais normais após um estímulo nóxico agudo e em animais monoartríticos após estimulação da pata artrítica, tendo-se verificado descida significativa da expressão de receptores nos animais com dor crónica. Estão em curso estudos farmacológicos que avaliam o efeito, em animais normais e monoartríticos, pelo recurso a testes comportamentais de avalição de limiares para a dor, da injecção de agonistas dos diversos receptores na região pró-nociceptiva do bolbo raquidiano (DRt). Nestes trabalhos inclui-se a administração de vectores víricos que codificam para um precursor da encefalina.



O CÓRTEX SUPRA-RENAL SOB O STRESS OXIDATIVO DURANTE O ENVELHECIMENTO.
Henrique de Almeida, Liliana Matos

Depois de estudos anteriores terem mostrado diminuição dos níveis circulantes de esteróides ao longo do envelhecimento, observou-se ainda um aumento acentuado de grânulos de lipofuscina (LPF), estruturas heterogéneas, que se julga acumularem produtos não digeríveis do metabolismo celular, designadamente, produtos da peroxidação lipídica. Dados obtidos em extractos de glândulas envelhecidas confirmaram a presença desses produtos, com valores crescentes ao longo da idade. Todavia, é incerto se este achado resulta do aumento da produção de radicais livres, ou da sua menor atenuação por acção dos mecanismos intracelulares homeostáticos. Para tal iniciou-se a pesquisa da actividade da dismútase do superóxido (SOD) em extractos totais e fracções celulares. A isoforma manganês foi encontrada em extractos mitocondriais como esperado, mas a isoforma Cobre-zinco surgiu também em extractos do hialoplasma e nucleares também, tornando necessária uma melhor purificação.



STRESS OXIDATIVO EM CÉLULAS ESTEROIDOGÉNICAS DO OVÁRIO.
Henrique Almeida, Liliana Matos e Delminda Neves

(Colaboram ainda os alunos Fátima Seabra e Michael Luís)

Em colaboração com a Unidade de Medicina da Reprodução do Departamento de Ginecologia/Obstetrícia da FMUP iniciou-se um projecto para estudo da actividade e expressão de SOD manganês e Cobre-zinco em células do cumullus oophorus humanas obtidas no decurso dos procedimentos de Reprodução Medicamente Assistida (RMA). A detecção da enzima MnSOD por imunocitoquímica revelou a sua localização dispersa no citoplasma enquanto que a determinação da sua actividade sugere que a mesma aumenta em casos de endometriose.



PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE NAS CÉLULAS ESTEROIDOGÉNICAS.
Henrique Almeida, Liliana Matos, Jorge Ferreira e Delminda Neves

O estudo da proliferação das células esteroidogénicas e das vias utilizadas na morte celular programada é de grande interesse biológico e tem sido objecto de diversos trabalhos ao longo de décadas.
Recentemente evidenciámos activação da caspase 3 nas zonas mais profundas do córtex durante a privação de ACTH, circunstância que se observou ao longo do envelhecimento. Os fenómenos finais de apoptose, estudados por microscopia electrónica e com a técnica TUNEL mostraram diminuição do índice apoptótico nos animais envelhecidos, sugerindo que a menor susceptibilidade dessas células ao estímulo pela ACTH também as torna menos sensíveis à privação da hormona. Está em curso o estudo quantitativo da actividade proliferativa no córtex supra-renal ao longo do envelhecimento.



VIAS DE SINALIZAÇÃO INTRACELULAR EM SITUAÇÕES DE STRESS E ONCOGÉNESE
Hélder Maiato, Jorge Ferreira e Duarte Pgnatelli

Grande parte dos mecanismos de resposta ao stress não é ainda totalmente compreendida. Neste contexto, a glândula supra-renal desempenha um papel preponderante dado que coordena parte da resposta que o organismo desencadeia. Assim sendo, vários modelos têm sido desenvolvidos, no sentido de esclarecer quais os mecanismos celulares e moleculares de resposta aos vários stresses que podem afectar o ser vivo. Este estudo visa clarificar quais as vias de sinalização intracelular que são activadas pela ACTH ou outros tipos de stress (nomeadamente oncogénese), e de que modo aquelas podem influenciar a expressão genética. Foi possível verificar que o stress activa várias vias de sinalização, nomeadamente as vias das ERKs 1/2 e p38 e que o aumento de activação das ERKs 1/2 se relaciona com o aumento de proliferação que ocorre nestas situações. Impõe-se agora clarificar qual o papel que a p38 desempenha na regulação do ciclo celular. Será ainda construído um modelo animal que desenvolva tumores da supra-renal, de modo a poder estudar alterações nas vias de sinalização nestas circunstâncias. Com este estudo espera-se contribuir para a identificação de novas terapêuticas que combatam o efeito nocivo do stress e o aparecimento de tumores.



ESTUDO DO TRÁFEGO INTRACELULAR DO RECEPTOR 5 DAS MELANOCORTINAS (MC5R) NAS CÉLULAS DA GLÂNDULA SUPRA-RENAL.
Alexandra Gouveia e Duarte Pignatelli

A glândula supra-renal apresenta um papel importante na resposta ao stress e na regulação da hipertensão arterial através da produção de hormonas esteróides (tais como glucocorticóides e mineralcorticóides). Este mecanismo de esteroidogénese encontra-se sob o  controlo de várias hormonas hipofisárias, denominadas melanocortinas. Na supra-renal foram identificados dois receptores principais para as melanocortinas (MCR), o MC2R e o MC5R, duas proteínas pertencentes à classe dos receptores associados às proteínas Gs (GPCRs). O MC2R é classicamente considerado o receptor da ACTH (hormona adrenocorticotrópica) enquanto que relativamente ao MC5R a sua função assim como os mecanismos inerentes ao seu tráfego intracelular permanecem por identificar. É consensualmente aceite que todos os GPCRs são sintetizados no retículo endoplasmático e têm como destino final a membrana plasmática, onde reconhecem e ligam especificamente os seus agonistas activando diversas vias de transdução de sinal. Posteriormente os receptores são internalizados e reciclados de volta para a membrana plasmática ou são endereçados para os lisosomas para degradação.
Com o objectivo de se estudarem os mecanismos subjacentes à expressão e maturação do MC5R, este projecto visa a caracterização do (i)Processo de exportação do MC5R do retículo endoplasmático até à membrana plasmática: recorrendo a técnicas de transfecção de culturas primárias de células da glândula supra-renal, culturas estas já desenvolvidas e caracterizadas previamente no nosso laboratório, pretendem-se determinar os motivos do MC5R necessários ao seu endereçamento para a membrana citoplasmática assim como identificar proteínas acessórias mediadoras deste processo; (ii)  Destino do MC5R após ligação ao agonista: a utilização de factores que interferem especificamente no processo de endocitose mediada por vesículas revestidas de clatrina ou na formação de cavéolas será útil na distinção destes processos. O papel putativo de outras proteínas será analisado, tais como arrestinas, cinases dos receptores associados às proteínas Gs e proteína cinase A.

(financiado pelo Programa de Estímulo à Investigação 2005 da Fundação Calouste Gulbenkian)



ANGIOGÉNESE NO CÓRTEX DA SUPRA-RENAL. ACÇÃO DA ACTH E DO STRESS
Duarte Pignatelli, Jorge Ferreira e Delminda Neves

O córtex da glândula supra-renal é muito vascularizado, estando cada célula de secreção endócrina em contacto com uma célula endotelial. Como tal, esta glândula tem merecido particular atenção nos estudos dos processos de angiogénese. No decurso dos trabalhos efectuados verificou-se um incremento acentuado da angiogénese quando se submete o córtex a estimulação continuada por ACTH ou em condições de stress. Verificou-se igualmente que o aumento de angiogénese após administração de ACTH poderá ser regulado parcialmente através da activação da via de sinalização das ERKs 1/2. Pretendemos agora estudar de que modo a estimulação crónica com ACTH induz a alteração da expressão do VEGF e dos receptores do VEGF, e de que modo a via das ERKs 1/2 pode regular este processo. Este estudo será efectuado in vivo e em células dissociadas, em cultura, provenientes de glândulas supra-renais de rato.



EFEITOS DO ENVELHECIMENTO, DIABETES, HIPERTENSÃO, OBESIDADE E HIPERCOLESTEROLEMIA NA MORFOLOGIA E NA EXPRESSÃO DE FACTORES DE CRESCIMENTO VASCULAR NO TECIDO ERÉCTIL
Pedro Vendeira, Nuno Tomada, Carla Costa, Inês Tomada, Henrique Almeida e Delminda Neves

A disfunção eréctil (DE), definida como a incapacidade persistente em obter e/ou manter uma erecção suficiente para permitir um desempenho sexual satisfatório e que apresenta uma alta prevalência na população geral está fortemente associada a outras patologias, tais como diabetes, hipertensão obesidade e hipercolesterolemia, assim como, ao envelhecimento e deficiência androgénica. A disfunção eréctil pode ter várias etiologias, sendo consensual que a etiologia vasculogénica é predominante. A erecção peniana trata-se assim de um processo vascular em que os vasos do pénis, nomeadamente os do corpo cavernoso são particularmente sensíveis a alterações funcionais e estruturais. Alterações estruturais e/ou ultra-estruturais nos componentes fibroelásticos das trabéculas penianas, músculo liso cavernoso e endotélio podem contribuir para uma inadequada expansão sinusoidal diminuindo a rigidez do pénis erecto. A ruptura da integridade funcional do endotélio vascular modifica a sua capacidade de resposta a alterações hemodinâmicas locais e a factores parácrinos e autócrinos, designando-se por disfunção endotelial. Esta designação (disfunção endotelial) é geralmente aplicada para referir a diminuição do relaxamento do músculo liso dependente do endotélio. De facto, a disfunção endotelial aparece ubiquamente associada à disfunção eréctil vasculogénica, o que levou mesmo Goldstein a considerar ED (erectile dysfunction) = ED (endothelium dysfunction). E com base nesta associação, a disfunção eréctil é considerada o sinal mais precoce de patologia cardiovascular, já que alterações funcionais do endotélio são mais tarde conducentes a patologia cardiovascular.
Neste trabalho utilizando modelos de rato com predisposição para a disfunção eréctil (diabético, idoso, orquidectomizado, hipertenso, hipercolesterolémico e obeso), procederemos a caracterização exaustiva dos componentes celulares e moleculares do tecido cavernoso. Resultados prévios demonstram expressão diferenciada dos receptores do VEGF (flt-1 e flk-1) no animal idoso. Em curso estão trabalhos em cultura de células isoladas de corpo cavernoso. Em colaboração com o Serviço de Urologia do Hospital de S. João estão também a ser iniciados estudos em corpo cavernoso humano colhido em cirurgia programada.



MODELAÇÃO MOLECULAR DA ANGIOGÉNESE NO CORPO CAVERNOSO USANDO MODELOS EXPERIMENTAIS: PERSPECTIVA PREVENTIVA E TERAPÊUTICA DA DISFUNÇÃO ERÉCTIL
Delminda Neves, Pedro Vendeira e Carla Costa

O envelhecimento é um conhecido factor de risco para a disfunção eréctil masculina. A investigação desenvolvida na última década permitiu concluir que a insuficiência vasculogénica é a etiologia predominante e responsável pela patofisiologia da disfunção eréctil nesta condição. Permanecem no entanto por definir quais as modificações morfológicas no tecido cavernoso e as alterações nos mecanismos moleculares angiogénicos responsáveis pela insuficiência endotelial. Na tentativa de esclarecer alguns destes aspectos, temos vindo a avaliar, em modelos de rato idoso e orquidectomizado, alterações estruturais da musculatura lisa e dos vasos sinosoidais cavernosos, bem como o potencial proliferativo, a activação da via de sinalização ERK1/2 e a incidência de apoptose do tecido eréctil. Resultados preliminares demonstraram aumento no calibre dos vasos no corpo cavernoso associado com o envelhecimento, bem como uma clara diminuição da proliferação associada a um decréscimo na activação de ERK1/2. A expressão de factores angiogénicos, nomeadamente o PlGF (Placental Growth Factor), será também avaliada nos diversos componentes do tecido cavernoso e em cultura de células endoteliais e musculares lisas isoladas do pénis de ratos idosos e noutros modelos animais com predisposição para a disfunção eréctil (diabéticos, hipertensos, hipercolesterómicos e obesos). Através da avaliação molecular destas alterações nos diversos modelos, delinearemos no futuro novas formas de prevenir e/ou corrigir patologias vasculares, como a injecção intracavernosa de PlGF ou implantação de células progenitoras endoteliais no tecido cavernoso.



A CONSCIÊNCIA DA DOR: ALTERAÇÕES INDUZIDAS POR DOR CRÓNICA NOS MECANISMOS NEUROBIOLÓGICOS DE APRENDIZAGEM, ATENÇÃO E RECOMPENSA
Vasco Galhardo, Miguel Pais-Vieira, Deolinda Lima, Clara Monteiro

A experiência dolorosa é universalmente considerada como a definitiva experiência consciente, uma vez que a percepção de dor está sempre associada a estados de consciência, e porque se admite que a percepção dolorosa se sobrepõe a qualquer outra experiência sensorial simultânea. No entanto, poucos estudos se têm debruçado sobre o efeito que uma dor crónica - ao provocar disrupção prolongada e persistente da consciência sensorial - pode ter na alteração a longo prazo de algumas faculdades cognitivas. Este projecto pretende debruçar-se sobre os mecanismos neurobiológicos que explicam duas questões essenciais: a forma como os estímulos dolorosos arrebatam a atenção sensorial e a forma como uma dor crónica pode alterar as respostas cognitivas dependentes de aprendizagem e planeamento futuro. O projecto assenta na junção de experiências de comportamento animal, com o registo neurofisiológico obtido por multieléctrodos implantados cronicamente em diferentes áreas corticais. Serão assim obtidos os "neural correlates" de duas tarefas comportamentais: uma tarefa de "attentional blink" e uma tarefa de planeamento estratégico dependente de processamento cortical frontal. Deste projecto esperamos obter conhecimentos sobre os mecanismos neurobiológicos implicados na tomada de decisões, bem como sobre o efeito que a percepção dolorosa persistente pode ter na alteração desses mecanismos corticais.



RECUPERAÇÃO DA PERCEPÇÃO TÁCTIL POR MICROESTIMULAÇÃO DE FIBRAS NERVOSAS PERIFÉRICAS
Vasco Galhardo, Clara Monteiro

Em situações de deaferentação periférica severa seguida de dor crónica - como no caso de amputação - ocorre reorganização dos mapas sensoriais centrais. Os neurónios das áreas corticais sensoriais estão distribuídos de forma somatotópica, na qual neurónios vizinhos codificam locais também vizinhos na superfície da pele. Se um nervo que conduz informação sensorial de uma determinada área da pele é cortado, os neurónios centrais deixam de responder a essa área e ao fim de algum tempo começam a responder à pele vizinha intacta. Foi demonstrado recentemente que existe alta correlação entre a magnitude da reorganização cortical e a intensidade da dor crónica. Este projecto é baseado na hipótese de que o restabelecimento artificial do estímulo sensorial em regiões centrais deafereniadas (talâmicas e corticais) irá restabelecer o equilíbrio original de forças nas áreas sensoriais, o que levará ao desaparecimento da dor central. Apesar de existirem dados indirectos que apoiam esta hipótese, esta teoria necessita ainda de ser testada experimentalmente. Assim, propomo-nos implantar uma nova geração de eléctrodos de estimulação multicanal em nervos periféricos seccionados. Estes eléctrodos são designados por "eléctrodos-crivo" pois possuem múltiplos orifícios através dos quais as fibras seccionadas podem regenerar. Este dispositivo permite a estimulação independente apenas das fibras que estão em contacto directo com cada abertura do eléctrodo, aumentando enormemente os actuais limites de resolução espacial da microestimulação periférica. Este projecto irá focalizar-se na aferição comportamental da discriminação táctil, usando tarefas comportamentais "match and non-match" simultaneamente com o registo da reorganização dos mapas somatossensitivos, por meio de multieléctrodos, em animais despertos sem restrição de movimentos. O objectivo final deste projecto é conseguir, por meio de microestimulação através de eléctrodos-crivo, evocar padrões corticais semelhantes aos produzidos por estimulação táctil natural. Este seria um passo importante para a eventual utilização de dispositivos electrónicos para restaurar o normal funcionamento em pessoas com deficiências sensoriais.



DEFICIÊNCIAS COGNITIVAS EM MODELOS ANIMAIS DE DOR CRÓNICA
Projecto POCTI/SAU-NEU/63034/2004 financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Deolinda Lima, Vasco Galhardo, Miguel Pais Vieira

Importantes progressos estão a ser feitos no conhecimento dos mecanismos neuroanatómicos, neurofisiológicos e neuroquímicos de diversos estados dolorosos. No entanto, a experiência subjectiva de dor em cada indivíduo apresenta desafios científicos únicos. Apesar da fisiologia básica ser similar, diferentes indivíduos reagem de variadas formas à dor, provavelmente devido a diversos factores (genéticos, endócrinos, imunológicos, actividade neuronal, stress, desenvolvimento, idade, sexo e background cultural). A dor crónica ou persistente, para além de ser um estado clínico que degrada a qualidade de vida, em muitos casos provoca também sérios distúrbios psicológicos. É neste momento claro que a dor crónica induz alterações complexas no cérebro, sendo necessário compreender como participam no processamento da dor outras estruturas cerebrais que não as do sistema somatossensitivo. Os estudos animais sobre este problema são escassos e a maioria do conhecimento actual provém de observações clínicas. No entanto, experiências controladas em modelos animais são um passo chave para apreciar como a dor modula estados cognitivos centrais, pois apenas neste caso será possível verificar em que medida a manipulação de um detrminado factor influencia outros. Recentemente abordámos este assunto numa série de estudos piloto que revelaram que ratos monoartríticos possuem curvas de aprendizagem mais lentas em duas actividades de comportamento diferentes, quando comparados com animais controlo. A medição simultânea dos níveis individuais de ansiedade comportamental demonstraram correlação entre ansiedade, dor e aprendizagem. Mais ainda, os nossos resultados preliminares sugerem que os níveis iniciais de ansiedade podem prever o nível de hiperalgesia pós-artrítica. Este projecto pretende dar continuidade a estes estudos e revelar os défices cognitivos específicos causados por dor crónica. Os resultados deverão contribuir para melhorar o tratamento da dor crónica, uma vez que a implementação de novas terapias no tratamento de ansiedade ou depressão relacionadas com dor crónica terão que ter em conta estes défices cognitivos.



EXCITABILIDADE DOS NEURÓNIOS SENSORIAIS ESPINHAIS E PERIFÉRICOS E A SUA MODULAÇÃO POR ANESTÉSICOS LOCAIS
Boris Safronov, Sónia Santos e Vitor Pinto

Os neurónios espinhais do corno dorsal (NCD) participam no processamento dos sinais recebidos dos axónios dos neurónios do gânglio raquidiano (NGR). As populações dos NCD e NGR são heterogéneas, de acordo com a diversidade das modalidades do processamento sensorial. Os NCD são adicionalmente classificados com base no seu disparo intrínseco, o que é determinado pela expressão específica dos canais iónicos dependentes de voltagem.
Recentemente, foram intensivamente estudados os canais de Na+ e de K+ em NCD tendo-se mostrado que a sua expressão não é homogénea quando comparados o soma, o axónio e as dendrites; tal facto é importante para a determinação da excitabilidade celular. Um outro factor, até agora ainda não considerado, é a morfologia celular. Uma vez que a morfologia determina as propriedades eléctricas passivas do neurónio, um estudo da correlação da organização duma célula com a sua capacidade para gerar as típicas formas de actividade eléctrica pode ser a chave para a compreensão dos mecanismos de disparo específico neuroniais.
Apesar disso, os NCD tal como os NGR são os alvos principais dos anestésicos locais (AL), os quais são considerados como  potentes bloqueadores dos canais de Na+. Todavia, as concentrações baixas dos AL afectam também os vários canais de K+ nos NCD. Os pequenos NGR do tipo C, que possuem axónios amielínicos e são conhecidos como nociceptores e termorreceptores, atraem grandemente a atenção dos investigadores que estudam a origem e o tratamento farmacológico da dor crónica, uma vez que, depois da lesão do nervo os pequenos NRG podem tornar-se  fontes de disparo ectópico. Esta dor pode ser tratada por concentrações baixas de AL que são insuficientes para um bloqueio da condutância no nervo. Por isso, parece que esta redução da actividade ectópica é, pelo menos em parte, causada pela acção dos AL nos canais de K+. Neste projecto 1) combinamos os métodos da electrofisiologia e anatomia para explicar os vários tipos de excitabilidade dos NCD e 2) estudamos a forma como a modulação dos canais de K+ pelos AL pode influenciar as propriedades de disparo dos NCD e dos NRG.



DISSECÇÃO MOLECULAR IN VIVO DAS VIAS MORFOGENÉTICAS DO FUSO MITÓTICO - IMPLICAÇÕES PARA A ANEUPLOIDIA E O CANCRO
Hélder Maiato

A mitose é um processo essencial para a vida. A perda ou o ganho de cromossomas durante a mitose, "aneuploidia", pode levar a defeitos no nascimento (ex: Síndrome de Down) e ter um papel crítico no cancro. De forma a manter a informação genética herdada, as células desenvolveram uma estrutura baseada em microtúbulos (MTs) - o fuso mitótico - que medeia a segregação dos cromossomas durante a divisão celular. Os modelos actuais para a formação do fuso mitótico em animais favorecem um papel activo dos centrossomas (CTs) como os únicos centros organizadores de MTs (COMTs), que nucleiam MTs dinamicamente instáveis para procurar e captar cromossomas. Os CTs têm vindo a ser propostos como responsáveis pela aneuploidia observada em mais de 20,000 tumores. Contudo, descobertas recentes demonstraram que a formação de um fuso funcional, assim como o movimento e segregação dos cromossomas pode ocorrer sem a presença de CTs, indicando que existe uma via para a formação do fuso independente destes organelos. Nós descobrimos que os cinetocóros, estruturas proteicas trilaminares presentes na região dos centrómeros, funcionam como COMTs, com um papel activo na morfogénese do fuso durante a mitose em células animais vivas. Contudo, os MTs organizados pelo cinetocóro não estão inicialmente orientados em direcção aos pólos. À medida que crescem, estes são capturados por MTs astrais provenientes dos CTs e são transportados em direcção aos pólos através de um mecanismo dependente da dineína. Assim, mesmo na presença de CTs, a formação de MTs pode ser iniciada pelos cinetocóros durante a mitose em animais. Neste projecto propomo-nos identificar as moléculas envolvidas nas vias morfogenéticas do fuso, centrossomal ou acentrossomal, em células animais, estudando directamente o papel do centrossoma na a aneuploidia. Para este propósito, desenvolvemos um sistema baseado em células em cultura de Drosophila vivas, com ou sem CTs, que expressam estavelmente GFP/tubulina e cuja mitose é plana sob uma película de agar. Este método representa um grande avanço para o uso de células de Drosophila em cultura como sistema modelo em estudos de biologia celular. Combinando a análise genética no contexto do organismo e a tecnologia de RNAi com a mais avançada microscopia em células vivas, esta abordagem representa um dos sistemas mais competitivos e capazes para a dissecção das vias morfogenéticas do fuso mitótico e o estudo da aneuploidia. Através de um rastreio ao nível do genoma por RNAi em células vivas ou usando candidatos já identificados obtidos da base de dados do genoma da Drosophila, seremos capazes de identificar as moléculas envolvidas na formação do fuso mitótico e investigar as respectivas contribuições dos CTs e cinetocóros. A subsequente análise molecular e funcional em células humanas, estabelecerá uma base experimental sólida para a compreensão do mecanismo de morfogénese do fuso durante a mitose em animais e como este poderá estar envolvido na aneuploidia e tumorigénese.



APPLICATION OF LASER MICROSURGERY TO DISSECT THE MOLECULAR MECHANISMS BEHIND CELL DIVISION, ANEUPLOIDYGENESIS AND CANCER
Hélder Maiato

Cancer is a leading cause of death worldwide. According to the World Health Organization more than 6 million people die every year from cancer, and it is predicted that cancer rates will continue to increase globally by 50% to 15 million new cases by 2020. In the particular case of Portugal, cancer kills more than 20 thousand people every year, representing the first cause of death in the country. The war on cancer is therefore a global action and demands a strong investment of our scientific resources. The proliferation of cells is the basis of human cancers and is also required for normal growth and reproduction. Cancer is therefore a cell problem. Each cell divides via a process known as 'mitosis' where the genetic information contained in DNA is compacted into chromosomes and must be correctly distributed to daughter cells. Any mistake in this process leads directly to aneuploidy (gain or loss of chromosomes) and chromosomal instability, a hallmark of human tumours. Missing chromosomes may result in the loss of critically important genes, whereas extra chromosomes may lead to unbalanced gene expression. Thus, understanding how mitosis works will ultimately lead to a better understanding of how cancer arises (for review see Rajagopalan and Lengauer, 2004).

Aneuploidy is also responsible for several human birth defects like Down Syndrome (trisomy of chromosome 21), Edwards Syndrome (trisomy of chromosome 8), Patau Syndrome (trisomy of chromosome 13), Turner Syndrome (absence of a sexual chromosome) and finally, Klinefelter Syndrome (gain of a third sexual chromosome). Another important link between mitosis and disease states is that the most successful drugs used in chemotherapy either target components of the mitotic machinery (e.g. paclitaxel, vinka alkaloids and topoisoisomerase inhibitors). Clearly, identifying the molecules involved in cell division, and understanding how they work together to effect mitosis, will reveal novel drug targets that can be used in the treatment of cancers. Combining high resolution live cell microscopy with recently-developed gene interference techniques provides an increasing powerful approach for studying, at the molecular level and within the physiological context of the cell, the mechanisms of mitosis. The project outlined in this proposal will combine these techniques with state-of-the-art laser microsurgery, to generate a technical synergism that will allow questions to be answered that were hitherto unapproachable. This approach will allow us to specifically target and manipulate different structural components of the mitotic apparatus in various genetic backgrounds and in the living cell. This project is also designed to promote the interaction between researchers from multidisciplinary fields, as it involves different domains of science including, e.g., optics, physics, engineering, biochemistry and genetics applied to the study of a major biological problem, with a strong implication for human health.



APLICAÇÃO DA MICROCIRURGIA LASER PARA O ESTUDO DOS MECANISMOS DE CONTROLO DA DIVISÃO CELULAR
Hélder Maiato

De acordo com a Organização mundial de saúde mais que 6 milhões de pessoas morrem por ano de cancro. Para além da proliferação celular estar na base do cancro, é também necessária para o normal desenvolvimento humano. As células dividem-se através de um processo conhecido como 'mitose' onde a informação genética contida no ADN é compactada sob a forma de cromossomas que deverão ser correctamente distribuídos no fim de cada ciclo celular. Qualquer erro neste processo poderá levar ao ganho ou perda de cromossomas contribuindo para uma instabilidade genética, que é uma característica de vários tipos de cancro, ao contrário da extrema constância genética verificada nas células normais. Desta forma, perceber como se dividem as células durante a mitose contribuirá decisivamente para uma melhor compreensão das origens do cancro e como este poderá vir a ser tratado. As células animais, incluindo os humanos, desenvolveram um mecanismo genético de controlo de qualidade da mitose, impedindo dentro de um determinado limite de tempo que estas avancem na presença de erros. Este mecanismo assenta essencialmente no envio de 'sinais' entre os cromossomas e o restante aparelho mitótico, contudo, a natureza e as implicações destes 'sinais' que controlam a fidelidade da mitose permanecem um enigma por descodificar. Através da combinação de microscopia de alta resolução em células vivas com a microcirurgia laser, este projecto permitirá manipular de forma controlada diferentes constituintes celulares de modo a obter respostas que de outra forma não seriam possíveis. Celebrando a ano internacional da física, este projecto pretende também promover a aplicação da física e suas ferramentas para o estudo de um problema biológico de grande relevância e com fortes implicações para a saúde humana.


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PROJECTOS DE INVESTIGAÇÃO FINANCIADOS

"Estudo do tráfego intracelular do receptor 5 das melanocortinas (MC5R) nas células da glândula supra-renal" (2006-2007) Programa de Estímulo à Investigação 2005 da Fundação Calouste Gulbenkian - Alexandra Gouveia

"Nociceptive spinal neuronal differentiation during embryonic development as a primary target of the transcription factor DRG11"; 2005-2008; FCT no. POCI/SAU-NEU/59093/2004 - D Lima

"Gene therapy for the control of chronic pain: role of the supraspinal pain modulatory system"; 2002-2006; FCT no. POCTI/NSE/38952/2001 - Tavares, I.

"A consciência da dor: alterações induzidas por dor crónica nos mecanismos neurobiológicos de aprendizagem, atenção e recompensa" (2005-2007) - projecto de investigação nº 84/04 da Fundação Bial - Galhardo V

"Recuperação da percepção táctil por microestimulação de fibras nervosas periféricas"(2005-2007) - projecto de investigação POCTI/SAU-NEU/59383/2004 finaciado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Galhardo V

"Deficiências cognitivas em modelos animais de dor crónica" (2005-2007) Projecto POCTI/SAU-NEU/63034/2004 financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia - Lima D

"Dissecção Molecular In Vivo das Vias Morfogenéticas do Fuso Mitótico - Implicações para a Aneuploidia e o Cancro" ( 2004-2007) Projecto POCI/SAU-MMO/58353/2004 financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Hélder Maiato

"Application of Laser Microsurgery to Dissect the Molecular Mechanisms Behind Cell Division, Aneuploidygenesis and Cancer" (2005-2007) Projecto L-V-675/2005 financiado pela FLAD - Hélder Maiato

"Aplicação da microcirurgia laser para o estudo dos mecanismos de controlo da divisão celular" (2006-2007) Programa Gulbenkian de Estímulo à Investigação - Hélder Maiato

"Estudo molecular da disfunção endotelial e da expressão de factores de crescimento vascular no corpo cavernoso na hipertensão arterial. Efeitos do tratamento com antagonista da angiotensina II, bloqueador ß e antagonista dos receptores da endotelina-1 na progressão da disfunção eréctil vasculogénica" Bolsa APU 2006 - Delminda Neves, Pedro Vendeira


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PUBLICAÇÕES SELECCIONADAS

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